NanoSpeck3D

IGF-Projekt: 01IF22462N  (2022 - 2024)

DIE HERAUSFORDERUNG

Bei der hochauflösenden 3D-Mikroskopie bewirken die begrenzte laterale und axiale Auflösung herkömmlicher Methoden Limitationen. Bestehende Verfahren wie die Einzelmolekül-Lokalisierungs-Mikroskopie, Mikroskopie mit stimulierter Emissionsverarmung (STED), oder Minimal-Photonenfluss-Lokalisations-Mikroskopie (MINFLUX) sind aufwändig und erfordern spezielle Probenpräparationen. Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) bedarf einer weniger aufwändigen Probenpräparation, ist jedoch technisch hinsichtlich ihrer zeitlich-räumlichen Auflösung begrenzt. Eine schnelle, nanometergenaue 3D-Darstellung lebender Zellen oder größerer Organismen ist derzeit mit keiner fluoreszenzbasierten hochauflösenden Mikroskopietechnik möglich. Für biomedizinische und industrielle Anwendungen wird eine kostengünstige, einfach integrierbare Lösung für superauflösende 3D-Rekonstruktionen benötigt. Die Herausforderung besteht in der Tiefenunschärfe, da es in biologischen Proben oft mehrere fluoreszierende Strukturen entlang eines Sichtstrahls gibt, was zu Mehrdeutigkeiten in der Tiefeninformation führt.

DIE INNOVATIONSIDEE

Ziel des IGF-Projekts war die Entwicklung eines kostengünstigen Mikroskopiemoduls für eine Intravitalmikroskopie mit < 50 nm lateraler, < 100 nm axialer und mit einer zeitlichen Auflösung von 1 s in einem ausgedehnten Volumen, ohne notwendige chemisch-toxische Probenvorbereitungen. Dies soll durch eine Kombination von strukturierter Beleuchtung der Probe mit mehreren wiederholbaren überlagerten und ansteuerbaren statistischen Mustern (Speckles) verschiedener Wellenlänge mit der dadurch angeregten nicht-linearen Antwort der Fluorophore sowie einem optimierten Kalibrierverfahren erzielt werden. Mit dem Mikroskopiemodul sollten hohe Projektionsraten und Rekonstruktionsraten von über 1 Hz erreicht werden. Weiterhin sollte ein alternativer 3D-Charakterisierungsansatz untersucht werden, bei dem eine Event-basierte Detektion und ein optisches Schnittverfahren zu einer verbesserten Tiefenauflösung führen könnten. Das zu entwickelnde Modul sollte in bestehende Mikroskopieplattformen integrierbar sein, um eine einfache Anwendung in der Biomedizin und Industrie zu ermöglichen.

DIE ERGEBNISSE

Im Projekt konnte ein Mikroskopiemodul mit einer hochfrequenten, Speckle-basierten Beleuchtung realisiert werden und erfolgreich in bestehende kommerzielle Mikroskope integriert werden. Bei der Verwendung monochromatischer Speckle-Muster konnten Projektionsraten von mehreren hundert Hz erreicht werden. Auch konnten eine Rekonstruktionsrate über 25 Hz und eine laterale Auflösung bis ca. 65 nm erreicht werden. Die angestrebte axiale Auflösung von < 100 nm konnte dagegen bei biologischen Proben unter reellen Untersuchungsbedingungen mit nur einer Kamera nicht erzielt werden: Entlang des Sichtstrahls trat meist mehr als ein fluoreszenter Objektpunkt auf, sodass keine eindeutige Tiefeninformation aus den Speckle-Mustern gewonnen werden konnte. Es wurde daher ein eventbasiertes Detektionsverfahren mit einer neuromorphen Event-Kamera und einem optischen Schnittverfahren entwickelt, das vielversprechende Ergebnisse zeigte.

Zur raum-zeitlichen Rekonstruktion wurde eine Korrelations-Software für die hochaufgelösten Aufnahmen der Proben mit den Speckle-Mustern entwickelt. Die hierfür entwickelten Algorithmen für die Auswertung und die Analyse-Protokolle sind auch auf andere Nanomaterialien und Partikeltypen übertragbar.

Mit der im Projekt entwickelten spektroskopischen 3D-Bildgebung konnten Nanopartikel hinsichtlich Größe, Morphologie und optischen Eigenschaften auf neuartige Weise charakterisiert werden. So konnte auch das Partikelverhalten in biologischen Umgebungen dreidimensional und mit hoher Sensitivität erfasst werden, sodass sich Rückschlüsse auf deren Stabilität, Aggregationsverhalten und Interaktion mit Zellen ziehen lassen. Weiterhin konnten erste Lebendzell-Messungen an intrazellulären Vesikeln durchgeführt werden.

KMU-NUTZEN

Die erarbeiteten Verfahren zur simultanen Erfassung von Streu- und Fluoreszenzsignalen eröffnen neue Möglichkeiten, Nanopartikel in komplexen biologischen Proben eindeutig zu detektieren und zu quantifizieren.

Das im Projekt entwickelte Mikroskopie-Modul entspricht einer skalierbaren Technologie, die bestehende Mikroskopieplattformen ohne kostenintensive Neuanschaffungen erweitern kann.

Die Projektergebnisse können in verschiedenen Bereichen, wie der Biomedizin, in der Neuroforschung für schnellste, hochauflösende Analysen subzellulärer Strukturen, in der Zellbiologie für Echtzeit-Monitoring von Organellen sowie in der Pathologie für eine verbesserte Diagnostik, verwendet werden. Hierfür können Unternehmen der mittelständisch geprägten Medizintechnik-Branche entsprechende Tools auf Basis der Projektergebnisse vermarkten. Die Projektergebnisse können jedoch auch für die Inspektion von Mikrochips und Wafern in der Halbleiterbranche, für hochauflösende Endoskopie- und Diagnosesysteme und die Analyse nanoskaliger Strukturen in der Materialwissenschaft genutzt werden.

Laufzeit: 01.07.2022 - 31.12.2024